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原代細(xì)胞如何獲取?

 更新時(shí)間:2023-08-17    點(diǎn)擊量:915

原代細(xì)胞(primary cell):是指從機(jī)體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個(gè)細(xì)胞并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞,稱為原代細(xì)胞。一般認(rèn)為,培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

原代細(xì)胞的獲取難度大、需要考慮的問題多,原代細(xì)胞如何獲?。?/span>

原代細(xì)胞的獲取,就是從活體上將組織分解成單個(gè)細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)的過程,且整個(gè)過程要求無菌操作。具體要考慮的問題有:組織分解的方式,培養(yǎng)的時(shí)間,換液時(shí)間,細(xì)胞狀態(tài)判斷和凍存。

一、組織分解的方式

將組織分解成單個(gè)細(xì)胞的方式目前主要有兩種:酶消化法和組織塊法(針對(duì)貼壁細(xì)胞)。

1. 酶消化法:所用試劑:膠原酶和胰酶。

 膠原酶的選擇:(根據(jù)自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實(shí)驗(yàn)成功的大前提。)

類型

適用組織

膠原酶

上皮、肺,脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離.

膠原酶

軟骨,肝臟,骨,甲狀腺,心臟和唾液腺組織細(xì)胞的分離。

膠原酶

消化組織中連接部分使其成為單個(gè)細(xì)胞,用于哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞解離

膠原酶

多種組織。

膠原酶

胰腺小島組織的分離,將結(jié)締組織分離成單個(gè)細(xì)胞。

膠原酶的配制:常用的是DMEM進(jìn)行配制,配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱(注意現(xiàn)用現(xiàn)配)。

膠原酶消化時(shí)間:根據(jù)組織特性,消化時(shí)間會(huì)有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例,加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后,放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,期間每隔10min中震蕩一次,知道組織塊幾乎wan全消失為止(若是組織塊剪得非常細(xì)小,時(shí)間可以短一些,30min左右即可)。

培養(yǎng)過程:注意原代細(xì)胞在培養(yǎng)2天后可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞液變黃(橘黃色)的現(xiàn)象,且無漂浮物,這是正?,F(xiàn)象哦,不是污染。這是由于細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過程中釋放了CO2和其他物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)液PH發(fā)生了改變,所以變黃。

2. 組織塊法

取材:取組織中間部位,剪成大小均勻的小方塊(1~4mm2),清洗干凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中,在培養(yǎng)皿中各組織塊要排列均勻。 

加液:培養(yǎng)液不能浸沒組織塊,避免組織漂浮。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h后換液。

二、培養(yǎng)時(shí)間

無論是酶消化法還是組織塊法,取樣后培養(yǎng)時(shí)間最少需要一周以上的時(shí)間,期間可換液或者傳代。

三、換液時(shí)間

無論酶消化法還是組織塊法,在培養(yǎng)期間需要隨時(shí)關(guān)注細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況,需觀察其是否貼壁,是否污染,組織塊法要觀察是否有細(xì)胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

四、細(xì)胞狀態(tài)判斷

正常貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后,會(huì)逐漸貼滿整個(gè)瓶底或者皿底,有的呈纖維狀,有的呈多邊形。這些細(xì)胞的狀態(tài)比較好,生長(zhǎng)至80%~90%融合就可以傳代啦,傳代一次后的細(xì)胞會(huì)更干凈漂亮。

五、凍存

傳一代后的細(xì)胞(也可以不傳代直接凍存)培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

凍存液配制:不同的細(xì)胞可能會(huì)有不同的凍存液配制方案,各實(shí)驗(yàn)室也有自己的凍存方案,

常見的方案有:

a: 10%DMSO+90%FBS;

b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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