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如何選擇熒光蛋白?

 更新時間:2023-08-31    點擊量:923

熒光標記在生物學眾多的研究領域中有著十分廣泛的應用,已經(jīng)成為研究體內(nèi)或細胞成像及生物細胞功能的重要工具。熒光標記方式一般有兩種,一種是細胞表達的熒光蛋白,另外一種是化學合成的熒光分子,此外,螢光素酶也是細胞標記的常用方法。每一種熒光分子都有其獨te的激發(fā)波長和發(fā)射波長。螢光素酶不同于熒光分子,其發(fā)光機制是利用酶與底物的反應,催化發(fā)出的化學發(fā)光,其發(fā)光并不需要激發(fā)光的參與,常用于體內(nèi)成像及螢光素酶報告基因的定量實驗。熒光蛋白如何選擇呢?讓我們一起來看看吧!

一、激發(fā)波長/發(fā)射波長

每一種熒光蛋白都有其獨te的激發(fā)波長和發(fā)射波長,因此,選擇的熒光蛋白必須是手上系統(tǒng)能夠激發(fā)和檢測得到的。舉例,如果你的顯微鏡只有488nm561nm兩個激發(fā)器,那你就不能夠選擇遠紅外熒光蛋白。又比如當使用不止一個熒光蛋白時,確保他們的發(fā)射波長沒有重疊,建議熒光使用先后順序,GFP/RFP/BFP/YFP/CFP。

二、寡聚反應

第一代熒光蛋白易于寡聚化,當和目的基因融合表達時,可能會影響目的基因蛋白的生物學功能。因此做融合表達時建議使用單體的熒光蛋白,比如mCherry/EGFP。

三、氧氣

許多熒光蛋白的成熟需要氧氣,特別是衍生自GFP的那些熒光蛋白,如EGFP/ECFP/EYFP。如果這些熒光蛋白處于缺氧環(huán)境,那可能就觀察不到熒光。

四、成熟時間

成熟時間是熒光蛋白正確折疊和產(chǎn)生發(fā)色團所需的時間,時間可能是幾分鐘到幾小時。舉例:superfolder GFP (sfGFP) mNeonGFP37°C所需時間小于10min;mCherry 需要大概15minTagRFP 需要大概100min;DsRed 大概需要10hours

五、溫度

溫度會影響熒光蛋白的成熟時間和熒光強度,比如EGFP適合37°C,所以EGFP最shi合哺乳動物或者細菌的研究,而GFPS65T相對適合酵母的研究。

六、亮度

熒光蛋白的亮度值由消光系數(shù)與量子產(chǎn)率的乘積計算得出。在許多情況下,將熒光蛋白的亮度與EGFP(設定為1)進行比較,有一些熒光蛋白非常暗淡(例如TagRFP657,其具有亮度只有0.1),因此亮度也需要考慮。

七、耐光性

長時間暴露在激發(fā)光下,熒光分子被漂白(即失去發(fā)光的能力)。光穩(wěn)定性可短至100毫秒(如EBFP)或長達1小時(如mAmetrine1.2)。但是,對于大多數(shù)熒光蛋白來說,它只需幾秒鐘到幾分鐘。另外,光穩(wěn)定性可能也會受實驗參數(shù)影響,例如激發(fā)光強度,pH或溫度等。

八、pH穩(wěn)定性

如果計劃在酸性環(huán)境中表達熒光蛋白,則此參數(shù)非常重要,一些熒光蛋白具有不同的ex/em光譜(例如mKeima)或在pH變化時熒光強度會發(fā)生改變(例如pHluorin,pHTomato),sensGFP在酸性環(huán)境會淬滅,如StubRFP-SensGFP-LC3B自噬探針。

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