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細胞傳代的實驗步驟是什么?有何注意事項?

 更新時間:2023-09-12    點擊量:991

在細胞培養(yǎng)過程中,去除原培養(yǎng)基并將細胞從原培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中,維持細胞的活力與增殖。細胞傳代既可以擴大細胞培養(yǎng)量,也能夠避免細胞因進入平臺期而出現(xiàn)生長抑制甚至死亡的情況。那么你知道細胞傳代的實驗步驟是什么嗎?有何注意事項呢?讓我們一起來看看吧!

一、實驗步驟

1. 貼壁細胞的傳代:

1) 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及密度,評估細胞的狀態(tài),以作為傳代比例的參考。

2) 提前紫外殺菌(至少30min為宜)操作臺及實驗材料。

3) 注意無菌操作,在操作臺中吸除或倒掉培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液(盡可能去除干凈,鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力)。

4) 加入適量PBS緩沖液洗滌1~2次。

5) 加入1~2 mL胰酶(以全部覆蓋細胞為準(zhǔn)),輕輕晃動培養(yǎng)皿,使胰酶充分接觸細胞(建議:胰酶分裝成適量,提前水浴復(fù)溫到37℃)。

6) 顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察細胞,當(dāng)細胞變圓且大多數(shù)細胞脫落時,表明此時細胞消化適度(加入胰酶后,邊計時邊顯微鏡下觀察,記錄細胞消化的時間,供今后細胞消化參考)

7) 加入2~3 mL 含血清完quan培養(yǎng)液(也可以考慮使用該細胞本次的培養(yǎng)上清),終止消化,輕柔吹打,使細胞完quan脫落。

8) 收集細胞懸液,轉(zhuǎn)移至離心管中,1500 rpm 離心5 min(必要時可以考慮,低速、短時間的離心有助于去除細胞碎片、細菌污染等)。

9) 棄去上清液,加入適量體積含血清培養(yǎng)液,重懸細胞,根據(jù)細胞生長速度、是否有密度依賴性及計劃傳代的時間等特點,按照比例將細胞懸液分裝入2個或多個無菌培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶內(nèi),培養(yǎng)皿內(nèi)可預(yù)先加入適量培養(yǎng)基。注意細胞充分混勻,保證細胞均勻分布。 

2. 懸浮細胞的傳代:可通過離心收集后用含血清的培養(yǎng)基直接傳代。

二、注意事項

1. 嚴(yán)格無菌操作!

2. 適度消化:提前復(fù)溫胰酶37℃以及消化計時,易保證消化過程穩(wěn)定。消化時間過長,容易影響細胞狀態(tài)及活性,消化時間過短易多細胞成團,影響實驗效果。

3.吹打過程要輕柔,避免細胞液的灑濺。

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