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你知道熒光原位雜交實驗的方法與步驟是什么嗎?

 更新時間:2023-10-07    點(diǎn)擊量:807

熒光原位雜交是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。那么你知道熒光原位雜交實驗的方法與步驟是什么嗎?讓我們一起來看看吧!

一、探針變性

將探針在 75℃恒溫水浴中溫育 5 min,立即置 0℃,5~10 min,使雙鏈 DNA 探針變性。

二、標(biāo)本變性

(1)將制備好的染色體玻片標(biāo)本于 50℃培養(yǎng)箱中烤片 2~3 h。(經(jīng) Giemsa 染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片)。

(2)取出玻片標(biāo)本,將其浸在 70~75℃的體積分?jǐn)?shù) 70% 甲酰胺/2×SSC 的變性液中變性2~3 min。

(3)立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 70%、體積分?jǐn)?shù) 90%和體積分?jǐn)?shù) 100%冰乙醇系列脫水,每次 5 min,然后空氣干燥。

三、雜交

將已變性或預(yù)退火的 DNA 探針 10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上,蓋上 18×18 蓋玻片,用 Parafilm 封片,置于潮濕暗盒中 37℃雜交過夜(約 15~17 h)。由于雜交液較少,而且雜交溫度較高,持續(xù)時間又長,因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài),此過程在濕盒中進(jìn)行。

四、洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針,從而降低本底。

(1)雜交次日,將標(biāo)本從 37℃溫箱中取出,用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

(2)將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱 42~50℃的體積分?jǐn)?shù) 50%甲酰胺/2×SSC 中洗滌3 次,每次 5 min。

(3)在已預(yù)熱 42~50℃的 1×SSC 中洗滌 3 次,每次 5 min。

(4)在室溫下,將玻片標(biāo)本于 2×SSC 中輕洗一下。

(5)取出玻片,自然干燥。

(6)取 200 μL 復(fù)染溶液(PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液)滴加在玻片標(biāo)本上,蓋上蓋玻片。

五、雜交信號的放大(適用于使用生物素標(biāo)記的探針)

(1)在玻片的雜交部位加 150 μL 封閉液 I,用保鮮膜覆蓋,37℃溫育 20min。

(2)去掉保鮮膜,再加 150 μL avidin-FITC 于標(biāo)本上,用保鮮膜覆蓋,37℃繼續(xù)溫育 40 min。

(3)取出標(biāo)本,將其放入已預(yù)熱 42~50℃的洗脫液中洗滌 3 次,每次 5 min。

(4)在玻片標(biāo)本的雜交部位加 150 μL 封閉液 II,覆蓋保鮮膜,37℃溫育 20 min。

(5)去掉保鮮膜,加 150 μL antiavidin 于標(biāo)本上,覆蓋新的保鮮膜,37℃溫育 40 min。

(6)取出標(biāo)本,將其放入已預(yù)熱 42~50℃的新洗脫液中,洗滌 3 次,每次 5 min。

(7)重復(fù)步驟(1)、(2)、(3),再于 2×SSC 中室溫清洗一下。

(8)取出玻片,自然干燥。

(9)取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片標(biāo)本上,蓋上蓋玻片。

六、封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有 Mowiol(可使封片液產(chǎn)生自封閉作用),為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā),可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20~-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。

七、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果

先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野,然后打開熒光激發(fā)光源,F(xiàn)ITC 的激發(fā)波長為490 nm。細(xì)胞被 PI 染成紅色,而經(jīng) FITC 標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。

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