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影響免疫熒光(IF)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些?

 更新時(shí)間:2023-10-08    點(diǎn)擊量:854

免疫熒光染色技術(shù)是一種以免疫學(xué)為基礎(chǔ),結(jié)合生物化學(xué)技術(shù)和顯微技術(shù)發(fā)展而來的蛋白等分子檢測(cè)技術(shù)。那么你知道影響免疫熒光(IF)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!

一、免疫熒光染色方法的選擇

免疫熒光染色技術(shù)分為直接法和間接法。

直接法:將熒光標(biāo)記物偶聯(lián)在抗原/抗體上,直接與相應(yīng)的抗體/抗原反應(yīng)。

間接法:先用未標(biāo)記的一抗與抗原充分反應(yīng)后,再利用熒光標(biāo)記的二抗與已經(jīng)結(jié)合在抗原上的一抗結(jié)合,達(dá)到檢測(cè)抗原的目的。


優(yōu)點(diǎn)

缺點(diǎn)

直接法

操作簡(jiǎn)單、特異性高,非特異性染色少便于相同宿主來源的不同蛋白的共定位

靈敏性相對(duì)比間接法低

間接法

靈敏度高,染色更加靈活,成本低。

相對(duì)直接法操作復(fù)雜

二、抗體的選擇

與目標(biāo)蛋白直接結(jié)合的一抗,在條件允許的條件下,盡量選擇相同來源的免疫原或者選擇已驗(yàn)證種屬反應(yīng)性的抗體。

如果進(jìn)行不同目標(biāo)蛋白的雙染或多染時(shí),這些不同蛋白所對(duì)應(yīng)的一抗應(yīng)該來源于不同宿主。


優(yōu)點(diǎn)

缺點(diǎn)

單克隆抗體

特異性高

靈敏度相對(duì)較低,制備過程復(fù)雜,價(jià)格也相對(duì)較高

多克隆抗體

制備過程簡(jiǎn)單,周期短,價(jià)格相對(duì)較低,靈敏度更高,對(duì)于表達(dá)量較低的目標(biāo)蛋白更容易檢出。

特異性相對(duì)較低

單克隆抗體與多克隆抗體、種屬免疫原、反應(yīng)性和抗體的宿主來源是抗體選擇最主要考慮的因素,其直接決定著免疫熒光染色的背景、特異性和成敗。熒光偶聯(lián)的二抗應(yīng)選擇與一抗相對(duì)應(yīng)的抗體,及抗一抗的二抗。

三、抗體保存

防止熒光抗體失活、污染以及熒光染料的脫落和淬滅。

在抗體保存過程中,適量分裝,避免反復(fù)凍融。

蛋白極易被塑料等吸附,如果用塑料管分裝,抗體中應(yīng)添加BSA等。

為防止污染也可以添加0.01%的硫柳汞或者0.1%的die氮化鈉。

為防止淬滅,保存熒光抗體時(shí)應(yīng)該注意避光,可以利用錫箔紙包好,或者放在避光的容器中。

四、培養(yǎng)載體的選擇

根據(jù)貼壁情況,細(xì)胞可分為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

貼壁細(xì)胞一般常用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng),接種細(xì)胞前放置0.17mm玻璃細(xì)胞爬片。

懸浮細(xì)胞常用6孔板培養(yǎng),免疫熒光染色處理后,取少量加在0.17mm玻璃細(xì)胞爬片上。

最后將細(xì)胞爬片倒扣到載玻片上,封片,放4℃保存。

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