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免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程有哪些?

 更新時(shí)間:2023-10-09    點(diǎn)擊量:747

免疫熒光是一種常用的光學(xué)顯微術(shù),即用熒光顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞中的特定生物分子。免疫熒光依賴(lài)于抗體抗原的特異性結(jié)合,然后通過(guò)直接標(biāo)記或間接標(biāo)記方法使用熒光分子指征抗體-抗原結(jié)合的位置,以確定目標(biāo)生物分子在細(xì)胞中的位置、豐度和分布情況。那么你知道免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程有哪些嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!

1. 固定

固定液種類(lèi):有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇、丙酮等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性。但針對(duì)磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,故應(yīng)選擇冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇,同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā),在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。

固定時(shí)間:取決于組合塊的大小和類(lèi)型,對(duì)于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細(xì)胞固定時(shí)間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。

2. 透化

通透的目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)。0.5% Triton X-100 室溫通透20 min(針對(duì)胞內(nèi)抗原,若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟);除了Triton X-100,丙酮也可作為通透劑,并且丙酮固定后的樣品不需要通透。

3. 封閉

封閉可減少一抗和二抗與非特異性位點(diǎn)結(jié)合。通透后用PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加山羊血清,室溫封閉30min。常用的封閉液包括:與二抗同一來(lái)源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開(kāi)始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類(lèi)固定的樣品,在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。

4. 一抗孵育

根據(jù)一抗說(shuō)明書(shū),按照適當(dāng)比例用一抗稀釋液稀釋一抗,用吸水紙吸盡封閉液,每張玻片滴加稀釋好的一抗并放入濕盒, 4℃孵育過(guò)夜?;厥找豢?,加入PBST, 在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5 min,共洗滌3次。

5. 熒光二抗孵育

用吸水紙吸盡洗滌液后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中孵育1h后,回收二抗,接著用PBST洗3次,每次5 min;由于熒光容易淬滅,故從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都要避光。

6. 復(fù)染核(定位的關(guān)鍵)

在玻片上滴加DAPI,并注意避光孵育5min,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核,然后用PBST洗3次,每次5min,洗去多余的DAPI。

7. 封片

用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察。

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