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PCR反應(yīng)污染的處理方法有哪些?

 更新時間:2023-10-13    點擊量:729

PCR反應(yīng)的特點是具有較大擴(kuò)增能力與靈敏性,但令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。那么你知道PCR反應(yīng)污染的處理方法有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!

一、環(huán)境污染

1. 稀酸處理法:對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡,使殘余DNA脫嘌呤。

2. 紫外照射(UV)法:紫外波長(nm)一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是,選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時,要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布,UV照射僅對500bp以上長片段有效,對短片段效果不大。UV照射時,PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體,這些二聚體可使延伸終止,但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體,且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長,嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。

二、反應(yīng)液污染

1. DNaseI法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5UDNaseI,室溫反應(yīng)30min后加熱滅活,然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA的序列。

2. 內(nèi)切酶法:選擇識別4個堿基的內(nèi)切酶(如MspI和TaqI等),可同時選擇幾種,以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷,室溫作用1h后加熱滅活進(jìn)行PCR。

3. 紫外照射法:未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射,注意事項與方法同上述UV照射法。

4. g射線輻射法:1.5kGy的輻射可wan全破壞0.1ng基因組DNA,2.0kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子,4.0kGy仍不影響PCR,但高于此限度會使PCR擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。

三、固相捕獲法

用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì),原理如下:

1. 用生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交,雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)。

2. 用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸,通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)。

3. 洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第2步的漂洗后可用PCR檢測以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。

四、抗污染引物法

該對引物擴(kuò)增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中,在重組質(zhì)粒中,這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本,也不能擴(kuò)增出任何條帶,即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶,其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增,因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的,該法試用于環(huán)狀靶分子系列。

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