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熒光原位雜交(FISH)的實驗步驟是什么?

 更新時間:2023-10-24    點擊量:864

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),是 20 世紀(jì) 80 年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。那么你知道熒光原位雜交(FISH)的實驗步驟是什么嗎?讓我們一起來看看吧!

一、實驗材料準(zhǔn)備

1. 實驗用具及材料

1)人的 MyoD1MYF3)基因探、人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本;

2)指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫 20 等;

3)恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400 熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等。

二、實驗方法及步驟

1. 探針變性

將探針在 75℃恒溫水浴中溫育 5 min,立即置 0℃,510 min,使雙鏈 DNA 探針變性。

2. 標(biāo)本變性

1)將制備好的染色體玻片標(biāo)本于 50℃培養(yǎng)箱中烤片 23 h。(經(jīng) Giemsa 染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片)。

2)取出玻片標(biāo)本,將其浸在 7075℃的體積分?jǐn)?shù) 70% 甲酰胺/2×SSC 的變性液中變性23 min。

3)立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 70%、體積分?jǐn)?shù) 90%和體積分?jǐn)?shù) 100%冰乙醇系列脫水,每次 5 min,然后空氣干燥。

3. 雜交

將已變性或預(yù)退火的 DNA 探針 10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上,蓋上 18×18 蓋玻片,用 Parafilm 封片,置于潮濕暗盒中 37℃雜交過夜(約 1517 h)。由于雜交液較少,而且雜交溫度較高,持續(xù)時間又長,因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài),此過程在濕盒中進行。

4. 洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針,從而降低本底。

1 雜交次日,將標(biāo)本從 37℃溫箱中取出,用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

2 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱 4250℃的體積分?jǐn)?shù) 50%甲酰胺/2×SSC 中洗滌3 次,每次 5 min

3 在已預(yù)熱 4250℃的 1×SSC 中洗滌 3 次,每次 5 min。

4 在室溫下,將玻片標(biāo)本于 2×SSC 中輕洗一下。

5 取出玻片,自然干燥。

6 200 μL 復(fù)染溶液(PI/antifade DAPI/antifade 染液)滴加在玻片標(biāo)本上,蓋上蓋玻片。

5. 雜交信號的放大(適用于使用生物素標(biāo)記的探針)

1 在玻片的雜交部位加 150 μL 封閉液 I,用保鮮膜覆蓋,37℃溫育 20min。

2 去掉保鮮膜,再加 150 μL avidin-FITC 于標(biāo)本上,用保鮮膜覆蓋,37℃繼續(xù)溫育 40 min

3 取出標(biāo)本,將其放入已預(yù)熱 4250℃的洗脫液中洗滌 3 次,每次 5 min。

4 在玻片標(biāo)本的雜交部位加 150 μL 封閉液 II,覆蓋保鮮膜,37℃溫育 20 min。

5 去掉保鮮膜,加 150 μL antiavidin 于標(biāo)本上,覆蓋新的保鮮膜,37℃溫育 40 min。

6 取出標(biāo)本,將其放入已預(yù)熱 4250℃的新洗脫液中,洗滌 3 次,每次 5 min

7 重復(fù)步驟(1)、(2)、(3),再于 2×SSC 中室溫清洗一下。

8 取出玻片,自然干燥。

9 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片標(biāo)本上,蓋上蓋玻片。

6. 封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有 Mowiol(可使封片液產(chǎn)生自封閉作用),為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā),可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。

7. 熒光顯微鏡觀察 FISH 結(jié)果

先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野,然后打開熒光激發(fā)光源,FITC 的激發(fā)波長為490 nm。細(xì)胞被 PI 染成紅色,而經(jīng) FITC 標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。

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