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常見的轉(zhuǎn)染方法的原理、特點及步驟

 更新時間:2023-11-10    點擊量:808

隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展,細胞轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究真核細胞基因功能的常規(guī)工具。常用于研究基因功能、基因表達調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學試驗中,其應(yīng)用非常廣泛。那么你知道常見的轉(zhuǎn)染方法的原理、特點及步驟嗎?讓我們一起來看看吧!

一、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA-脂質(zhì)體復合物,也能被表面帶負電的細胞膜吸附,再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目前實驗室zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性,所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。

特點:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的優(yōu)點是能夠高效轉(zhuǎn)染許多細胞系,適用于高通量篩選,并能夠遞送任何大小的 DNA 以及 RNA 和蛋白。此外,該方法既可應(yīng)用于穩(wěn)定表達,也可應(yīng)用于瞬時表達,與其他化學方法不同的是,其可用于將 DNA RNA 向動物和人體內(nèi)轉(zhuǎn)移;缺點是轉(zhuǎn)染效率依賴于細胞類型和培養(yǎng)條件,因此,需要對每種細胞類型的轉(zhuǎn)染條件和轉(zhuǎn)染試劑進行優(yōu)化。

實驗步驟:將DNA,RNA,siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中,脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復合物粘附到細胞膜上→復合物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

二、電穿孔法

利用電脈沖可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的膜上小孔,同時細胞膜上電勢升高,驅(qū)使帶電荷的分子(如 DNA)以類似于電泳的方式經(jīng)臨時微孔穿過細胞膜進入胞內(nèi)(見下圖)。當遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下,高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。為確保轉(zhuǎn)染成功,針對實驗條件優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)是極為重要的。電場強度、脈沖形狀、脈沖施加次數(shù)、緩沖液組分等因素都會影響轉(zhuǎn)染效率。

特點:與其他轉(zhuǎn)染方法相比,電轉(zhuǎn)染具有諸多優(yōu)勢,其中主要優(yōu)勢包括:適用于所有細胞類型的瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;在確定最佳電轉(zhuǎn)染條件的情況下,能夠在短時間內(nèi)轉(zhuǎn)染大量細胞。電轉(zhuǎn)的主要缺點在于高電壓脈沖可引起大量細胞死亡,僅部分細胞膜可以成功修復,因此相比化學轉(zhuǎn)染方法,電轉(zhuǎn)染需要使用更多數(shù)量的細胞。

實驗步驟:利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細胞→對含有核酸,緩沖液,細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差,誘導產(chǎn)生暫時的孔使核酸進入細胞→將細胞返回到生長培養(yǎng)基中,使其慢慢恢復→檢測基因表達或沉默情況。

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