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如何選擇合適的流式抗體?

 更新時(shí)間:2024-01-05    點(diǎn)擊量:722

  由于在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,熒光抗體對(duì)單細(xì)胞懸液的標(biāo)記效果直接影響實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此,需要考慮各種影響流式抗體品質(zhì)及檢測(cè)效果的因素,例如抗體特異性、熒光素信號(hào)強(qiáng)弱、熒光素標(biāo)記方式、同型對(duì)照等。那么你知道我們?cè)?span style="color: rgb(255, 0, 0);">如何選擇合適的流式抗體嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!

  流式抗體本身也是抗體,所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件:目標(biāo)蛋白特異性,反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過(guò)程,以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi),建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而不去做間接標(biāo)記。

一、流式抗體熒光標(biāo)記的選擇

  如果實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)單一指標(biāo):不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同。以某儀器為例:PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5,通常來(lái)說(shuō),PEzui強(qiáng),適用于弱表達(dá)抗原。FITC強(qiáng)度較弱,適用于強(qiáng)表達(dá)抗原,使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇。

  如果同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo):確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道,流式抗體每個(gè)通道只能選擇1種熒光素。各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。如實(shí)驗(yàn)者同時(shí)檢測(cè)三個(gè)指標(biāo),可以在下圖中綠色、黃色和紅色三個(gè)通道中各選一個(gè)適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記,F(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個(gè)通道的熒光標(biāo)記,以防止熒光的重疊和相互干擾,影響最后結(jié)果。因此,流式細(xì)胞儀的通道越多,同一份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

二、同型對(duì)照的選擇:

  流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和其他抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)有點(diǎn)不同的就是需要選擇同型對(duì)照。同型對(duì)照,是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色,相當(dāng)于實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。同型對(duì)照選擇與標(biāo)記抗體同種屬來(lái)源,同亞型,同熒光標(biāo)記的抗體。比如:抗人的CD3的PE標(biāo)記的抗體,小鼠的IgG2a。同型對(duì)照選擇PE標(biāo)記的小鼠的IgG2a。

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