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雙熒光素酶實驗的注意事項有哪些?

 更新時間:2024-01-09    點擊量:1102

雙螢光素酶報告基因通常以螢火蟲螢光素酶為報告基因,以海腎螢光素酶為內參基因,如此所構成的報告系統(tǒng)有檢測靈敏度高、動態(tài)范圍廣、內參平衡等優(yōu)勢,因此在實驗中得到廣泛應用。那么你知道雙熒光素酶實驗的注意事項有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!

一、熒光值過高

熒光值過高可能會超出儀器檢測范圍,從而檢測不到值,一般讀數(shù)在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決:

1.減少質粒轉染量;

2.細胞樣品裂解后,離心取上清后檢測或對裂解產物進行稀釋后檢測。

(注:不建議通過減少底物量來降低熒光值,需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實的表達水平,否則會造成檢測結果出現(xiàn)大的偏差。)

二、熒光值過低或無熒光值

1. 啟動子活性低

a.優(yōu)化細胞的培養(yǎng)條件,提高熒光素酶的表達量;

b.更換強啟動子(如SV40、CMV)。

2. 轉染效率低

a.優(yōu)化轉染實驗條件,用較易轉染的質粒做陽性對照(如轉染過表達熒光蛋白質粒);

b.確保轉染DNA的質量,可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質量進行鑒定;

c.選擇活性較高,處于指數(shù)分裂期的細胞進行轉染。

3. 樣品裂解效率低

a.細胞培養(yǎng)時間不宜過長,12-36h內最好,長時間培養(yǎng)后,細胞可能會難裂解;

b.加入的裂解液需足量,保證細胞能夠充分裂解。

4. 熒光信號衰減

熒光素酶的半衰期一般約30min,加完底物后可立即檢測,盡量在30min內完成。

5. 底物氧化失效

a.底物避光密封保存,螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存;海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存;

b. 反應工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

三、如何判斷轉染成功

1. 如轉入的miRNA帶熒光標記如GFP,則可直接在轉染后、細胞裂解前,顯微鏡下觀察細胞熒光;

2. 如轉入的miRNA不帶任何熒光標記,可考慮進行miRNA的qRT-PCR檢測,通過檢測結果判斷實驗組2、4、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達;

3.設置一個熒光質粒轉染參照組,同批轉染一個組的細胞,間接反映出同批次實驗的轉染情況。

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