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Trizol法RNA提取的實驗流程和注意事項

 更新時間:2024-03-05    點擊量:977
  Trizol是一種酸性試劑,能從細胞和組織中快速分離RNA,其主要成分為異硫氰酸胍(GITC)和苯酚。裂解細胞后,GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性,有利于保護RNA的完整性;加入氯仿離心后,樣品分為水相和有機相,RNA存在于上層水相中,而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機相中,從而達到分離的目的。簡單來講就是裂解細胞使RNA得以釋放,加之有機溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離,并進一步純化得到RNA的過程。那么你知道Trizol法RNA提取的實驗流程和注意事項是什么嗎?讓我們一起來看看吧!
 
  1.樣品的制備
 
  1)細胞:按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細胞的比例加入Trizol試劑(注:一般來講待細胞在六孔板上生長至80%左右時,每孔收集的細胞加1ml Trizol即可);
 
  2)組織:按1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比例加入Trizol試劑并在冰上勻漿處理,以利于RNA的釋放(注:組織可以先用液氮急凍后研磨處理,也可用勻漿器或者組織研磨器進行處理,但要注意保持低溫,以防RNA降解);
 
  室溫裂解5-10min。
 
  2.氯仿抽提
 
  每1ml Trizol中加入200ul的氯仿,蓋好EP管蓋后用手劇烈顛倒混勻15s左右,室溫孵育2-3min。2-8℃,12000g離心15min后溶液分為三層,從上到下依次為水相(RNA)、中間層及有機相(DNA、蛋白質(zhì)等),轉(zhuǎn)移水相至新的EP管中(注:此步一定要小心謹慎,慢慢吸取,不可觸及中間層,以免RNA被污染)。
 
  3.異丙醇沉淀
 
  每1ml Trizol中加入500ul異丙醇,上下顛倒混勻后,室溫孵育10min,2-8℃,12000g離心10min,得到的白色沉淀即為RNA沉淀(注:異丙醇最好提前預冷,維持低溫環(huán)境,以防RNA被降解)。
 
  4.乙醇洗滌
 
  棄去上清,加入1ml 75%乙醇(每1ml Trizol)洗滌RNA沉淀,2-8℃,7500g離心5min(注:75%乙醇可以用無水乙醇及無酶水來配制,同樣最好預冷處理;清洗時動作要輕柔,過于劇烈會導致RNA沉淀散開,再次離心未免會重聚,從而造成RNA的損失)。
 
  5.溶解
 
  棄去上清,于通風櫥內(nèi)干燥RNA沉淀5-10min,用50ul左右的無酶水重懸沉淀,即可得到RNA溶液(注:干燥時間不可過長,太過干燥會導致沉淀很難溶解,部分溶解的RNA的260/280的比值會大大降低,甚至低于1.6;亦可采用金屬浴60℃,5min以助溶)。
 
  6.RNA質(zhì)量的檢測
 
  1)微量分光光度計
 
  純RNA的260/280比值在2.0左右,若比值偏小,則代表可能有蛋白或有機溶劑的污染,比值偏大則代表RNA可能發(fā)生降解。
 
  2)瓊脂糖凝膠電泳
 
  可見三條帶,從上往下一般為28s RNA、18s RNA及5s RNA,一般情況下5s的帶非常淡,甚至看不清,28s帶的亮度應(yīng)為18s帶亮度的2倍,且不存在拖尾,即可證明RNA純度可以,如若5s很明顯,而28s 與18s帶的亮度并無太大差別,甚至出現(xiàn)涂抹狀的條帶則高度提示RNA降解。
 
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