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天根感受態(tài)細(xì)胞(CB104-01)現(xiàn)貨供應(yīng)

 更新時(shí)間:2024-03-21    點(diǎn)擊量:625

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高達(dá) 108 cfu/µg,具鏈霉素抗性,其轉(zhuǎn)化后單菌落的生長數(shù)多,生長速度比 DH5α 略快,相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)生長的菌斑略大于DH5α。適用于高效的 DNA 克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增。能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定復(fù)制。

操作步驟:

使用前請(qǐng)先在漂洗液PW中加入無水乙醇,加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。

1. 柱平衡步驟:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL,12,000 rpm(~13,400×g)離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。(使用當(dāng)天處理過的柱子)

2. 取1-5 ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中,12,000rpm (~13,400×g)離心1 min,盡量吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中)。

3. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250μI溶液P1(請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A),使用移液器或渦旋振蕩器徹di懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。

注意:如果有未徹di混勻的菌塊,會(huì)影響裂解,導(dǎo)致提取量和純度偏低。

4. 向離心管中加入250μl溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。

注意:溫和地混合,不要?jiǎng)×艺鹗?,以免打斷基因組DNA,造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片斷。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠,所用時(shí)間不應(yīng)超過5min,以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮,可能由于菌體過多,裂解不徹di,應(yīng)減少菌體量。

5. 向離心管中加入350μl溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次,充分混勻,此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm(~13,400×g)離心10min,用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到過濾柱CS(過濾柱放入收集管中),注意盡量不要吸出沉淀。

注意:P3加入后應(yīng)立即混合,避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀,可再次離心后取上清。

6. 12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min,小心地將離心后收集管中得到的溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中),(如果過濾柱中有殘余的液體說明步驟5吸取的上清中雜質(zhì)過多,可以延長離心的時(shí)間;如果離心后收集管底部有少量的沉淀,盡量的吸取上清)。

7. 12.000 rpm (~13,400×g)離心30-60 sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP3放入收集管中。

8.向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD,12,000rpm (~13.400×g)離心30-60 sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP3放入收集管中。

 9. 向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇),12,000 rpm(~13,400×g)離心30-60 sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱CP3放入收集管中。

10.重復(fù)操作步驟9。

11.將吸附柱CP3放入收集管中,12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

注意:漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響,建議將吸附柱CP3開蓋,置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹di晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

12.將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100μI洗脫緩沖液TB,室溫放2min,12,000rpm(~13,400×g)離心2min,將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

注意:為了增加質(zhì)粒的回收效率,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,重復(fù)步驟12。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用ddH20做洗脫液,應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi),pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μl,體積過小影響回收效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20°C,以防DNA降解。

產(chǎn)品選購:

貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

CB104-01

感受態(tài)細(xì)胞

10×100 μl


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