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流式細(xì)胞儀怎么分選T細(xì)胞?

 更新時(shí)間:2024-11-18    點(diǎn)擊量:407

上文介紹了流式細(xì)胞術(shù)的原理及應(yīng)用,今天讓我們學(xué)習(xí)一下怎么用流式細(xì)胞儀分選T細(xì)胞吧~

一、樣本制備

1.取樣100μL抗凝血。

2.標(biāo)記:根據(jù)抗體說明書標(biāo)記實(shí)驗(yàn)管?;靹蚝?,室溫避光孵育15分鐘。

3. 溶血:將10×裂紅液用水稀釋10倍,每管加入1mL,振蕩器混勻后室溫避光靜置10分鐘,300g4°C離心5分鐘。

4. 洗滌:棄去上清,加入1mL 1×PBS洗液,300g離心洗滌5分鐘,洗2-3次。

5. 上機(jī)檢測(cè):棄去上清后加入500μL 1×PBS,混勻懸浮后過濾,避光等待上機(jī)檢測(cè)。

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二、儀器操作

1. 打開流式細(xì)胞儀、開啟液流、質(zhì)控。

2. 分選前設(shè)置:共包含兩個(gè)步驟,第一,調(diào)節(jié)合適的液流斷點(diǎn),待四路窗口形成清晰的5路液流,其中含4個(gè)收集液流,一個(gè)廢液流后,利用“sweetspot"鎖住此斷點(diǎn);然后利用Accudrop 珠子,調(diào)整 “Drop Delay"時(shí)間,當(dāng)左側(cè)液流接近 100%,而且保持相對(duì)穩(wěn)定的范圍的時(shí)間是最佳時(shí)間。

3. 設(shè)置分析條件:完成質(zhì)控后,建立用戶文件夾、當(dāng)日實(shí)驗(yàn)文件夾,根據(jù)細(xì)胞標(biāo)記,選擇所需參數(shù),根據(jù)各抗原之間生物關(guān)系及實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注點(diǎn),畫好 FSC-SSC及各熒光參數(shù)兩兩相對(duì)的散點(diǎn)圖,根據(jù)抗原生物關(guān)系設(shè)置分析門,及群級(jí)聯(lián)關(guān)系表。

4. 確定電壓:先上對(duì)照管,根據(jù)淋巴細(xì)胞在 FSC-SSC散點(diǎn)圖中的位置,調(diào)整 FSCSSC兩個(gè)參數(shù)的電壓,保證淋巴、單核及中心粒細(xì)胞呈現(xiàn)在合適的位置,然后設(shè)置P1 門圈住淋巴細(xì)胞;根據(jù)陰性細(xì)胞群位置,調(diào)整好其它熒光參數(shù)的電壓,記錄10000個(gè)細(xì)胞。

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5. 分類計(jì)數(shù):上陽性管,通過分級(jí)設(shè)門,完成各抗原之間生物關(guān)系的呈現(xiàn),及各細(xì)胞分類計(jì)數(shù)情況。

6. 分選設(shè)置:在“sort layout"窗口,設(shè)置收集裝置和純度模式,然后設(shè)置分選門,圈住CD4CD8 陽性的細(xì)胞,將分選門分別填入左右“sort location field" 框中。

7. 分選:將收集管中分別裝200ul 1XPBS,放入儀器分選倉下面的收集管架上:點(diǎn)“sort"開始分選,此時(shí)“sort location field"框中可見所獲得的CD4CD8陽性的細(xì)胞數(shù)目;收集到足夠的目的細(xì)胞后,停止分選。

8.細(xì)胞純度檢測(cè):利用上樣針清洗液和水清洗上樣針,直到以水上樣時(shí),FSC-SSC散點(diǎn)圖中無點(diǎn)"為止。將分選獲得的CD4陽性細(xì)胞上樣回測(cè),觀察細(xì)胞分選純度;再次清洗上樣針,將分選獲得CD8陽性細(xì)胞上樣回測(cè),觀察細(xì)胞分選純度。

 

通過以上實(shí)驗(yàn)步驟,我們可以成功分選并收集到特定的T細(xì)胞群體。

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益元利康是一家專注于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室快速消耗品為主營方向的生命科技企業(yè),提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系,為廣大的科研用戶提供實(shí)驗(yàn)室一站式服務(wù)。益元利康已成為多家生物品牌的代理商,如ALZETMedKoo、EZBWaKo、Zymo research、Qiagen等,為用戶提供完善的產(chǎn)品、專業(yè)的咨詢,助力推動(dòng)中國生命科學(xué)研究快速發(fā)展。

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