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PCR buffer基本組分

 更新時間:2024-11-25    點擊量:934

一、buffer是干什么的?

PCR buffer(緩沖液)的作用就是給Taq酶提供一個最適的反應條件。一般含有TrisHCL,Mgcl2+等成分。不同的pcr buffer成分可能不一樣。


PCR buffer基本組分

二、buffer基本組分

1、Tris-HCl:具有良好的緩沖能力和對多種酶的兼容性,在PCR中的主要作用是調(diào)節(jié)反應體系的pH值,使PCR反應過程維持在一個穩(wěn)定的ph范圍內(nèi);為酶反應提供恒定的酸堿環(huán)境,保持酶的活性,確保PCR擴增的順利進行。

2、K+:主要發(fā)揮穩(wěn)定酶活性和參與模板DNA的解鏈作用。適當?shù)拟涬x子濃度可以維持Taq酶的活性,從而提高PCR反應的效率;結(jié)合到DNA鏈上的磷酸基團上,中和負電荷,減弱雙鏈復性時的負電荷相斥,穩(wěn)定引物-模板復合體。

3、NH4+NH4+以銨離子和氨的形式存在,可以與堿基之間的氫鍵發(fā)生相互作用,使錯配堿基間的不穩(wěn)定的氫鍵容易斷開,在退火時促進引物的特異性結(jié)合。

4、Mg2+:和dNTP結(jié)合成復合物,作為聚合酶的底物,是聚合酶的激活劑;結(jié)合到DNA鏈上的磷酸基團上,中和負電荷,減弱雙鏈復性時的負電荷相斥,穩(wěn)定引物-模板復合體。

三、注意

對于 Taq DNA聚合酶,緩沖液的一個常見成分是來自KCl的鉀離子(K+),其可促進引物的吸附。有時,也可使用硫酸銨(NH4)2SO4 代替KCl。銨離子(NH4+)具有去穩(wěn)定作用,尤其對于錯配引物-模板復合物堿基對之間的弱氫鍵,因此可增強反應特異性。

PCR buffer基本組分

Mg2+ 濃度過低會降低聚合酶活性,導致PCR產(chǎn)物較少或無PCR產(chǎn)物。另一方面, Mg2+ 濃度過高則會提高引物-模板復合物的穩(wěn)定性,產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物,并增加由dNTP錯誤插入導致的復制錯誤。由于NH4+ Mg2+具有拮抗效應,因此,在各種 Mg2+ 濃度下,含有(NH4)2SO4 的緩沖液都表現(xiàn)出更高的引物特異性。

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