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如何選擇合適的感受態(tài)細(xì)胞

 更新時(shí)間:2023-11-06    點(diǎn)擊量:763

  細(xì)菌轉(zhuǎn)化是受體細(xì)菌以低頻率從環(huán)境中吸收外源DNA的天然過程,經(jīng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌可表達(dá)相應(yīng)的遺傳形狀,是遺傳多樣性的來源之一,也可能為宿主細(xì)菌帶來額外的好處(如抗生素抗性)。感受態(tài)細(xì)胞是通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行誘導(dǎo),使其處于最適攝取或容納外源DNA的生理狀態(tài),可高效吸收環(huán)境中的DNA分子。那么你知道該如何選擇合適的感受態(tài)細(xì)胞嗎?讓我們一起來看看吧!

  感受態(tài)細(xì)胞常用于分子克隆中,用于復(fù)制增殖重組DNA分子。但感受態(tài)細(xì)胞多種多樣,當(dāng)選擇感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí),需要考慮多種因素,如轉(zhuǎn)化方式、轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)化通量、感受態(tài)細(xì)胞的遺傳背景等,更重要的是實(shí)驗(yàn)研究目標(biāo)。這些因素會(huì)直接影響細(xì)菌轉(zhuǎn)化的成功率。

一、轉(zhuǎn)化方式

  選擇感受態(tài)細(xì)胞時(shí),轉(zhuǎn)化方式是需要考慮的重要因素之一。轉(zhuǎn)化方式分為熱激和電轉(zhuǎn)兩種,對(duì)應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞即為化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。選擇哪種轉(zhuǎn)化方式取決于實(shí)驗(yàn)所需的轉(zhuǎn)化效率、所轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA的類型、數(shù)量及復(fù)雜度等。

熱激和電轉(zhuǎn)兩種轉(zhuǎn)化方式各有優(yōu)劣。熱激(化學(xué)轉(zhuǎn)化)不需要配套設(shè)備,一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行,轉(zhuǎn)化效率能滿足日常克隆或亞克隆需求。由于化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞是通過陽離子和熱激處理使其細(xì)胞膜穿透性增強(qiáng),所以對(duì)于某些具有細(xì)胞壁的菌株,化學(xué)轉(zhuǎn)化則不太適合。

  相比較而言,電轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化效率更高。因此電轉(zhuǎn)可用于不同濃度(從低濃度到飽和濃度)、不同大小、不同復(fù)雜度DNA的轉(zhuǎn)化。那些不能制成化學(xué)感受態(tài)的菌株可以制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)。但進(jìn)行電轉(zhuǎn)需要額外的設(shè)備,如電轉(zhuǎn)儀和電轉(zhuǎn)杯。此外,針對(duì)不同的菌株,可能還需要對(duì)電轉(zhuǎn)方案進(jìn)行優(yōu)化。

二、轉(zhuǎn)化效率

  轉(zhuǎn)化效率可反映出感受態(tài)細(xì)胞攝取超螺旋質(zhì)粒的數(shù)量,因此轉(zhuǎn)化效率會(huì)影響到克隆效率。感受態(tài)細(xì)胞具有不同的轉(zhuǎn)化效率,受制備方法、所轉(zhuǎn)化DNA類型、存儲(chǔ)條件等多種因素的影響。

  對(duì)于大部分分子克隆實(shí)驗(yàn),1061010 CFU/µg的轉(zhuǎn)化效率已經(jīng)足夠。對(duì)于超螺旋質(zhì)粒的常規(guī)克隆或亞克隆,大約106 CFU/µg級(jí)別的轉(zhuǎn)化效率即可滿足。對(duì)于復(fù)雜DNA,如平末端連接產(chǎn)物、短插入片段或微量DNA,需要具有更高轉(zhuǎn)化效率(~108109 CFU/µg)的感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化效率>1×1010 CFU/µg)則推薦用于最ju挑戰(zhàn)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化,如gDNAcDNA文庫(kù)構(gòu)建、>30 kb質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化等。

三、轉(zhuǎn)化通量

  要進(jìn)行的轉(zhuǎn)化反應(yīng)數(shù)量多少也是一個(gè)需要考慮的因素。由于需要電轉(zhuǎn)儀和電擊杯,且設(shè)置自動(dòng)化流程比較困難,所以電轉(zhuǎn)不太適用于進(jìn)行高通量分子克隆。

  相比之下,使用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞通過熱激進(jìn)行轉(zhuǎn)化可以靈活用于不同的實(shí)驗(yàn)通量。對(duì)于低通量的細(xì)菌轉(zhuǎn)化,單管包裝的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞可以直接進(jìn)行熱激,可避免因反復(fù)凍融造成的轉(zhuǎn)化效率降低。對(duì)于中通量的細(xì)菌轉(zhuǎn)化,可選擇預(yù)裝入聯(lián)管中的感受態(tài)細(xì)胞,再借助多通道移液器進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對(duì)于高通量細(xì)菌轉(zhuǎn)化,選擇預(yù)裝入96孔板的感受態(tài)細(xì)胞,可實(shí)現(xiàn)模塊化孵育,甚至可兼容自動(dòng)化。

四、細(xì)菌基因型

  一個(gè)細(xì)菌菌株定義為一個(gè)細(xì)菌種類下面的一個(gè)子類,相比親本野生型具有某些特定的遺傳變異。常用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株包括DH5α、BL21HB101JM109。每個(gè)菌株可通過基因型進(jìn)行描述,基因型中列出了諸如插入或缺失突變。菌株的基因型在決定其是否適用于特定克隆實(shí)驗(yàn)中具有關(guān)鍵作用。

  基因的功能和表型可通過基因型中的三個(gè)字母符號(hào)來表示。相關(guān)的基因可通過三個(gè)字母基因名稱后面的大寫字母進(jìn)行區(qū)別,如lacYlacZlac操縱子的兩個(gè)不同基因。表型也可通過基因型中以大寫字母開頭且不是斜體的幾個(gè)字母進(jìn)行鑒定,如圖3TetR代表INV110菌株的四環(huán)素抗性。

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